Théorie d'enzymologie

Chapitre du cours de Biochimie I

dernière mise à jour: 12 décembre 2002

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Sommaire

Vous pouvez aussi trouver de la théorie et des exercices (en anglais) dans le Biology Hypertextbook du MIT, chapitre d'enzymologie


Réaction simple

Ce qui empêche la conversion d'une substance chimique en une autre, c'est la barrière énergétique qui les sépare: Entre les deux substances, il faut passer par un état de transition particulièrement défavorable.

La vitesse de la réaction de A à B dépend de l'énergie d'activation (DEa1) nécessaire pour arriver à l'état de transition (E.T.).

La vitesse de la réaction de B à A dépend de l'énergie d'activation (DEa2) nécessaire pour arriver à l'état de transition (E.T.).

L'énergie d'activation est fournie par l'agitation thermique. On peut donc accélérer une réaction en chauffant.

L'équilibre de la réaction de A à B dépend de la différence d'énergie libre standard (DG0'), mais pas de la hauteur de la barrière.

Modèle: deux lacs de niveaux différents séparés par une digue.

Le passage d'eau de gauche à droite est déterminé par la hauteur de la digue en dessus du niveau moyen du lac de gauche, mais aussi par la fréquence de vagues dépassant cette hauteur.
Le passage d'eau de droite à gauche est déterminé par la hauteur de la digue en dessus du niveau moyen du lac de droite, mais aussi par la fréquence de vagues dépassant cette hauteur.

Des vagues plus hautes dues à une agitation plus forte augmenteront le passage d'eau dans les deux sens et aboutiront plus vite à égaliser le niveau des deux lacs.

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Cinétique

Pour une réaction simple, la vitesse de formation de B (ou de disparition de A) est proportionnelle à la concentration de A:

Vitesse de réaction: d[B]/dt = - d[A]/dt = k1[A] (constante de vitesse)

Comme la réaction inverse a aussi lieu, le changement de [B] dépend de la différence des deux vitesses de réaction:

d[B]/dt = - d[A]/dt = k1[A] - k-1[B]

Equilibre: d[B]/dt = - d[A]/dt = 0

Donc, à l'équilibre: k1[A]eq = k-1[B]eq

[B]eq / [A]eq = k1/ k-1 = Keq (constante d'équilibre)

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Décours de la réaction, vitesse initiale

Concentrations de A et B en fonction du temps, en commençant avec [A]o =10 et [B]o =0

k1 =0.3, k-1 =0.125, Keq = 2.4

Les deux concentrations s'approchent de leurs valeurs d'équilibre,

[A]eq =2.94 et [B]eq =7.06

La vitesse de réaction est difficile à mesurer en présence de A et B, surtout à l’équilibre !

On mesure donc en déséquilibre total, c’est-à-dire la vitesse initiale:

[B] = 0 ; d[B]/dt = - d[A]/dt = k1[A] , ou

[A] = 0 ; d[A]/dt = - d[B]/dt = k-1[B]

Graphiquement, la vitesse initiale est la pente de l'asymptote de la courbe pour t=0:

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Pourquoi des enzymes?

A. Accélération

Un(e) enzyme est un catalyseur biologique, donc elle accélère une réaction qui serait beaucoup trop lente sans elle.

Notice: On peut dire une ou un enzyme. Il est cependant plus logique d'utiliser le féminin, car toutes les enzymes ont des noms féminins, sauf un(e): le lysozyme.

Modèle des trains:

1. A pied:



Pour voyager entre Neuchâtel (435 m, 32'000 habitants) et La Chaux-de-Fonds (1000 m, 38'000 habitants), il faut passer le col de la Vue-des-Alpes (1283 m).

Dans notre modèle très simplifié, ce sont les différences d'altitude qui influencent le comportement des habitants:

Ce qui retient les marcheurs, c'est la perspective d'une montée de 848 m dans un sens, de 283 m dans l'autre.
Pour cette raison, seuls 0.2% des Neuchâtelois vont à La Chaux-de-Fonds chaque mois (
k1), soit 64 par mois (v1), alors que 0.5% (k-1) des Chaux-de-Fonniers prennent le chemin inverse, soit 190 par mois (v-1). L'équilibre sera atteint lorsqu' autant de personnes voyageront dans les deux sens:

v1 = v-1 = k1Neq = k-1Ceq

Donc = Neq / Ceq = k-1 / k1 = 0.5 / 0.2 = 2.5

A l'équilibre il y aura donc:

Neq = 50'000 Neuchâtelois et Ceq = 20'000 Chaux-de-Fonniers

L'équilibre dépend de la différence d'altitude entre les deux villes, soit 565 m., mais pas de l'altitude du col, qui influence seulement la rapidité dans les deux sens. Avec les constantes de vitesse données plus haut, il faudra des années pour atteindre l'équilibre.

S'il y avait 100x plus d'habitants, 100x plus d'entre eux traverserait le col.

Notice historique pour les non-Neuchâtelois: Il peut y avoir des fluctuations massives. Ainsi, le 1er mars 1848, une forte escouade de Montagnards (de La Chaux-de-Fonds, du Locle et des villages voisins) a traversé le col de la Vue-des-Alpes pour aller chasser du château de Neuchâtel les représentants du roi de Prusse, alors également Prince de Neuchâtel. Depuis cette révolution réussie sans effusion de sang, le 1er mars est la fête nationale de la République et Canton de Neuchâtel.

2. En train:

Le train accélère les voyages entre les deux villes. Il y a maintenant trois réactions distinctes:

Monter (ou descendre) dans le train à Neuchâtel, le voyage proprement dit, et descendre (ou monter) du train à La Chaux-de-Fonds.

S'il y a peu d'habitants dans une des villes, la vitesse de transport dépendra du nombre d'habitants et du nombre de places dans les trains. S'il y a beaucoup d'habitants, c'est le nombre de places dans les trains qui limitera la vitesse. La vitesse maximale sera atteinte lorsque toutes les places seront prises.

Si le train a une capacité de 2000 personnes par jour (vitesse maximale), l'équilibre sera atteint en quelques jours pour les nombres donnés plus haut.

Par contre, s'il y avait 100x plus d'habitants, le train ne transporterait toujours que 2000 personnes par jour au maximum (saturation des transports publics).

Notice pour les non-Neuchâtelois: En fait plus de monde voyage par l'autoroute que par le train, car ce dernier est lent et fait des détours. C'est pourquoi il est question de déveloper une "enzyme" plus efficace, c'est-à-dire une ligne de métro direct entre les deux villes.

On peut déduire de ce modèle trois propriétés importantes des enzymes:

  1. Accélération de la réaction dans les deux sens
  2. Equilibre inchangé
  3. Saturation

Accélération mais équilibre inchangé:

Concentrations de A et B en fonction du temps, en commençant avec [A]o =10 et [B]o = 0

Keq = 2.4 , [A]eq =2.94 et [B]eq =7.06

traits fins: sans enzyme, traits épais: avec enzyme (accélération 10x)

(En fait, une enzyme accélère souvent une réaction plus de 1'000'000'000 x !)

Accélération de la réaction inverse et équilibre inchangé:

mêmes constantes mais en commençant avec [A]o =0 et [B]o = 10

B. Canalisation

Parmi plusieurs réactions possibles, c’est la réaction catalysée qui aura lieu.

Au lieu de:
on aura:

Modèle: trois lacs de niveaux différents séparés par des digues.

Le passage d'eau d'un lac à un autre est déterminé par la hauteur de la digue (énergie d'activation) en dessus du niveau moyen du lac de départ , mais aussi par la fréquence de vagues dépassant cette hauteur (agitation thermique).

Des vagues plus hautes dues à une agitation plus forte augmenteront le passage d'eau dans les deux sens et aboutiront plus vite à égaliser le niveau des trois lacs.

En abaissant sélectivement une digue, on accélère l'égalisation de ces deux lacs, au détriment du troisième:

C'est le principe des systèmes d'irrigation, où la montée ou descente des écluses déterminent dans quel canal va circuler l'eau.

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Réaction catalysée par une enzyme

Il y a au moins trois réactions simples:

  1. Fixation du substrat (S) sur l'enzyme (E), formation du complexe (ES)
  2. Transformation du substrat lié (ES) en produit lié (EP)
  3. Dissociation du complexe (EP), largage du produit (P)

Pour chaque réaction il y a une différence d'énergie libre et une barrière d'activation à franchir. A chaque constante de vitesse correspond une énergie d'activation (plus DEa est grande, plus k est petite):

La différence d'énergie libre (DG) entre substrat et produit ne dépend pas de l'enzyme. L'équilibre n'est donc pas modifié par l'enzyme!

Ici aussi, la vitesse de réaction est difficile à mesurer en présence de S et P, surtout à l’équilibre!

On mesure donc de préférence en déséquilibre total, c’est-à-dire la vitesse initiale:

En début de réaction, il n'y a pas de P, et on présume que le complexe EP se dissocie plus vite qu'il ne se forme à partir de ES, c'est-à-dire que k3 > k2, k-2 . La réaction qui limite la vitesse de formation de P est la réaction k2. Dans ces conditions, le schéma se simplifie:

Leonor Michaelis et Maud Menten ont déduit de ce modèle en 1913 une équation qui prédit la vitesse initiale (de formation de P )en fonction de la concentration du substrat:

Vitesse initiale de la réaction: vo = d[P]/dt = k2·[ ES ]

La vitesse de réaction dépend de la concentration du complexe enzyme-substrat ES.
Il faut donc calculer la concentration de
ES:

ES se forme à partir de E + S et se décompose soit en E + S , soit en E + P .

Vitesse de formation de ES: vf = k1·[ E ]·[ S ]

Vitesse de dégradation de ES: vd = (k-1+ k2)·[ ES ]

[ ES ] atteint rapidement une valeur constante (condition dite de "steady state"),

donc vd = vf

(k-1+ k2)·[ ES ] = k1·[ E ]·[ S ]

[ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] / KM

KM = (k-1+ k2) /k1 = constante de Michaelis (-Menten)

Il faut maintenant connaitre la concentration de l'enzyme libre [ E ].

[ E ] = [ E ]T - [ ES ]

[ E ]T est la concentration totale d'enzyme, libre ou lié. On a donc:

[ ES ] = ([ E ]T - [ ES ])·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM - [ ES ]·[ S ] / KM

[ ES ] + [ ES ]·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM

[ ES ]·( 1 + [ S ] / KM ) = [ E ]T·[ S ] / KM

[ ES ]·(KM + [ S ]) / KM = [ E ]T·[ S ] / KM

[ ES ]·(KM + [ S ]) = [ E ]T·[ S ]

[ ES ] = [ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ])

On peut enfin introduire ce terme dans l'équation pour la vitesse initiale:

vo = k2·[ ES ] = k2·[ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax·[ S ] / (KM+ [ S ])

Equation de Michaelis-Menten

Cas spéciaux ou extrêmes

[ S ] >> KM vo = vmax·[ S ] / [ S ]

vo = vmax

vo indépendente de [ S ],

saturation, asymptote

[ S ] << KM vo = vmax·[ S ] / KM dépendence linéaire de [ S ],

substrat limitant, asymptote

[ S ] = KM vo = vmax· KM / 2 KM

vo = vmax / 2

demi-saturation de l'enzyme

Graphe de Michaelis-Menten: vo en fonction de [ S ]

vmax est la vitesse maximale que peut atteindre la réaction lorsque l'enzyme est saturée de substrat,
c'est-à-dire lorsque [
E ]T = [ ES ].

KM est la concentration de substrat qui sature l'enzyme à moitié.
C'est une mesure de l'affinité de l'enzyme pour le substrat: plus l'affinité est élevée, plus
KM est petit.

k2 (= vmax/ [ E ]T) est souvent appelée constante catalytique kcat, et représente le nombre de cycles catalytiques par seconde (nombre de rotations) dont est capable l'enzyme.

Le rapport kcat/KM est souvent aussi donné comme mesure de l'efficacité catalytique, car il correspond à une constante de vitesse pour de basses concentrations de substrat ( [ S ] << KM, donc [ E ] = [ E ]T)

vo = vmax·[ S ] / KM = kcat·[ E ] ·[ S ] / KM =[ E ] ·[ S ] · kcat/KM

Quelques exemples tirés de Voet, Voet & Pratt, Fundamentals of Biochemistry:
Enzyme Substrat KM
(mM )
kcat
(s-1)
kcat/KM
(M-1·s-1)
Accélération
par rapport
à la réaction non-catalysée
Acétylcholinestérase Acétylcholine
000.095
1.4 x 104
1.5 x 108
Anhydrase carbonique CO2
012.00
1.0 x 106
8.3 x 107
HCO3-
026.00
4.0 x 105
1.5 x 107
Catalase H2O2
025.00
1.0 x 107
4.0 x 108
Chymotrypsine N-acétylglycine
éthyl ester
440.00
5.1 x 10-2
0.12
N-acétylvaline
éthyl ester
088.00
1.7 x 10-1
1.9
N-acétyltyrosine
éthyl ester
000.660
1.9 x 102
2.9 x 105
107
Fumarase Fumarate
000.005
8.0 x 102
1.6 x 108
1011
Malate
000.025
9.0 x 102
3.6 x 107
Uréase Urée
25.00
1.0 x 104
4.0 x 105
1014

Les exemples de l'anhydrase carbonique et de la fumarase montrent qu'on peut faire l'analyse pour les deux directions de réaction. L'exemple de la chymotrypsine montre les différences observées entre deux mauvais substrats et un bon substrat.

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Linéarisation de l'équation de Michaelis-Menten

Il est difficile de placer correctement à la main une hyperbole dans un graphe. On se trompe très facilement sur la hauteur de vmax . Pour simplifier l'évaluation des résultats, on utilise une transformation de l'hyperbole en droite. La plus connue est la transformation en double-réciproque de Lineweaver et Burke:

1 / vo = 1 / vmax + (KM / vmax )· 1 / [ S ]

Cette équation représente une droite de pente KM / vmax

L'intersection sur l'axe vertical est 1 / vmax et sur l'axe horizontal 1 / KM .

Graphe de Lineweaver-Burk: 1/vo en fonction de 1/[ S ]

Cette représentation permet d'estimer les constantes à l'aide de papier millimétré et d'une règle. Elle a cependant le défaut de donner trop de poids aux valeurs expérimentales les plus imprécises, celles des plus petites concentrations de substrat (voir exercice 1)

Bien qu'il soit de nos jours possible (et statistiquement plus correct) d'ajuster par ordinateur une courbe hyperbolique aux points expérimentaux, la présentation selon Lineweaver et Burk est encore souvent utilisée pour présenter des résultats (par ex. en insert d'un graphe de Michaelis-Menten) car ils donnent une impression immédiate de la qualité des mesures expérimentales.

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Unités d'activité enzymatique

Unité officielle: katal (kat), quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde. Le katal n'est jamais utilisé, car beaucoup trop grand. On doit utiliser des sous-unités comme les µkat (10-6 katal), nkat (10-9 katal) ou pkat (10-12 katal).

La plupart des biochimistes préfèrent l' "unité internationale" (IU, International Unit), qui est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 µmole de substrat par minute. 60 IU valent donc 1 µkat.

Le nombre de rotations ( kcat ) est le nombre de molécules de substrat transformées par molécule d'enzyme par seconde (ou le nombre de moles de substrat transformé par mole d'enzyme.
On peut aussi calculer l'
activité molaire, le nombre de moles de substrat transformé par mole d'enzyme par minute (kcat x 60).
Si on connait pas le poids moléculaire de l'enzyme, on peut quand même mesurer l'
activité spécifique , soit l'activité par mg de protéine purifiée. Normalement, elle est donnée en IU/mg protéine (ou µkat/mg).

Si on calcule l'activité spécifique sur un extrait non-purifié (soit un mélange de protéines), elle indique la pureté d'une enzyme.
Au cours d'une purification d'enzyme, on mesurera donc régulièrement:

l'activité totale (IU ou µkat)
la quantité totale de protéines (mg)
et le volume total de solution (ml).

De ces trois valeurs, on pourra calculer:

l'activité spécifique (activité totale / quantité totale de protéine, IU/mg),
le rendement (activité totale / activité totale avant la première étape de purification)
et le taux de purification (activité spécifique / activité spécifique avant la première étape de purification).

L'activité spécifique et le taux de purification atteigne une valeur maximale lorsque l'enzyme est pure.

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Exercices

(Source: B.B.Torres (1998) Biochemical Education 26, 294-296)

L'urée ( O=C(NH2)2 ) peut être décomposée en CO2 et NH4+.
Des tubes contenant différentes concentrations d'urée et 0,1 µg d'uréase (sauf le tube 12) ont été incubés pendant 10 min. à 30°C.
Après incubation, la concentration de NH4+ a été déterminée.
Les résultats sont présentés dans le tableau suivant:

Tube No. Urée (mM) NH4+ (µmol)
1 1.0 0.10
2 2.5 0.20
3 5.0 0.40
4 10 0.68
5 25 1.20
6 50 1.61
7 100 1.92
8 500 2.26
9 1000 2.32
10 2000 2.35
11 4000 2.36
12 4000 0.00

Questions:

a) Pourquoi n'y a-t-il pas eu production de NH4+ dans le tube 12?
b) Quelle était la vitesse de réaction dans le tube 5?
c) Quels étaient les paramètres dont dépendaient les vitesse de réaction?
d) Que vous attendriez-vous à trouver après une très longue incubation?
e) Quels changements dans le contenu du tube pourraient-il vous donner une plus grande vitesse de réaction?
f) En vous basant sur la théorie de Michaelis et Menten, pouvez-vous estimer KM et vmax ?

Réponses et graphes

Exercice 2, repris du MIT hypertextbook:

Deux souches de Bacterium sweetans, A et B, utilisent le saccharose (sucre de cuisine) comme seule source de carbone.
La première étape du processus d'utilisation du saccharose est son passage à travers la protéine transporteuse de saccharose dans la membrane de la bactérie.
Voici les caractéristiques de la protéine transporteuse de saccharose de ces deux souches (en supposant que [E]tot est identique):

Souche
A
B
KM
1000 mM
10 mM
vmax
1000 mmol/min
100 mmol/min

a) Si la vitesse de transport du saccharose est l'étape critique pour la vitesse de croissance des bactéries, quel souche poussera-t-elle mieux si la concentration de sucre est : 10 mM? 100 mM? 1000 mM?

b) Quelle souche a-t-elle été isolée du sol d'une pelouse, laquelle du sol d'un stand de glaces?

Réponses

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Enzymes avec plusieurs substrats

Avec plusieurs substrats, la théorie devient un peu plus compliquée.

Il faut en particulier distinguer différents mécanismes selon l'ordre de fixation et de largage des différents substrats et produits. Ces mécanismes peuvent être distingué selon l'influence de la concentration d'un substrat sur vmax et KM de l'autre substrat:

1.Mécanisme séquentiel ordonné

Si le site actif de l'enzyme a la forme d'une poche, l'un des substrats doit pénétrer en premier.

2.Mécanisme séquentiel aléatoire

Si les sites de fixation sont les deux accessibles à la surface de l'enzyme, l'ordre de fixation importe peu.

3.Mécanisme en ping-pong

Souvent un premier substrat transmet un groupe chimique à l'enzyme, qui le transmet au second substrat (réaction de transfert de groupe). Un premier produit quitte l'enzyme avant que le second substrat vienne se lier. Après la première réaction, l'enzyme est modifiée. C'est la deuxième réaction qui restore l'état initial.

Exemple:

Les transaminases contiennent un groupe prosthétique, le pyridoxal (un aldéhyde; pyridoxine = vitamine B6), qui peut être aminé en pyridoxamine:

E-pyridoxal + glutamine <--> E-pyridoxamine + glutamate

E-pyridoxamine + aspartate <--> E-pyridoxal + asparagine

Autres exemples: les protéases (par ex. la trypsine), les chitinases de la famille 18 (alors que celles de la famille 19 ont un mécanisme ordonné).

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Réponses et compléments aux exercices

Uréase

a) Sans enzyme, la réaction est beaucoup plus lente (1014 fois). Il faudrait attendre 1.9 Mio années pour obtenir le même résultat!

b) 1.2 µmol en 10 min, soit 0.12 µmol/min ( 0.12 IU ), ou 2 nmol/sec ( 2 nkat )

c) la vitesse de réaction dépend de la concentration du substrat et de celle de l'enzyme, mais aussi de la température et du pH

d) la réaction devrait atteindre l'équilibre

e) en augmentant la concentration d'enzyme, on augmente la vitesse de réaction

f) Estimation de KM et vmax:

Graphe en double réciproque avec droites de régression:

Les deux points à droite sont peu précis (plus petites [S]) et faussent la droite. C'est un défaut de cette méthode graphique. La droite rouge a été calculée sans ces deux points.

Le même graphe agrandi sur les petites valeurs montre bien l'influence des petites valeurs de [S] et v:

Voici les valeurs calculées pour ces deux droites:

1/vmax 1/KM vmax KM
4.86 0.0487 0.206 20.5
4.19 0.0402 0.238 24.8
0.238 ±0.005 24.5 ±0.27

La dernière ligne contient les valeurs calculées par un programme de régression pour enzymes.

Voici le graphe des résultats avec les courbes calculées avec les valeurs déduites plus haut. Les valeurs noires donnent une courbe presque identique à la courbe rouge.

Retour à l'exercice de l'uréase

Transport de saccharose

Souche
A
B
KM
1000 mM
10 mM
vmax
1000 mmol/min
100 mmol/min

a) En insérant les valeurs dans l'équation de Michaelis-Menten, on obtient:

[S]
A: v0 B: v0
10 mM
9.9 mmol/min
50 mmol/min
100 mM
90.9 mmol/min
90.9 mmol/min
1000 mM
500 mmol/min
99 mmol/min

La souche A pousse donc plus vite à haute concentration de saccharose, la souche B à basse concentration. A 100 mM elles poussent à la même vitesse.

b) La souche A est évidemment mieux adaptée à pousser sur le sol fortement sucré du stand de glace. Par contre dans une pelouse, c'est la souche B qui pousse mieux.

Retour à l'exercice

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